Introdução
Analisadores de tamanho de nanopartículas tradicionais empregam a técnica de espalhamento de luz dinâmico (DLS), iluminando amostras com um feixe de laser e detectando flutuações de luz espalhada causadas pelo movimento browniano das partículas suspensas em um líquido. A flutuação de intensidade original ao longo do tempo é processada por meio de cálculos de correlação para derivar a função de correlação.
Diferentes modelos matemáticos, como Cumulantes, NNLS ou CONTIN, são usados para determinar o tamanho e a distribuição de tamanho.
O modo de lote é comumente utilizado por analisadores DLS, que se refere ao modo de teste tradicional com cubetas de quartzo ou plástico, e exibe baixa resolução para teste de distribuição de tamanho, especialmente de amostras amplamente distribuídas. Além disso, o cálculo da distribuição de tamanho é extremamente dependente do algoritmo e sua maior resolução só pode distinguir entre componentes individuais de uma distribuição estreita com uma diferença de 2,5-3 vezes no tamanho das partículas, limitando muito a natureza quantitativa dos resultados da distribuição de tamanho.
Em contraste, o modo de fluxo DLS, quando conectado a um dispositivo de separação front-end, pode detectar individualmente o tamanho de cada componente do efluente. Cada componente do efluente é idealmente monodisperso ou estreitamente monodisperso, e os sinais obtidos por meio de detectores de concentração produzem informações de distribuição de tamanho independentes de algoritmos, com uma resolução tão alta quanto 1,3:1.
Nesta aplicação, o BeNano 180 Zeta Pro foi conectado a um dispositivo front-end SEC (Size Exclusion Chromatography) e a distribuição de tamanho da Albumina Sérica Bovina (BSA) foi analisada.
Instrumentos
O BeNano 180 Zeta Pro foi utilizado, empregando um laser de 50 mW, 671 nm e coletando sinais de espalhamento de luz a 173°. A medição utilizou uma cubeta de fluxo de baixo volume de 27μL. Usando um coletor de sinais BFC-1, sinais analógicos saídos do detector de Índice de Refração (RI) do dispositivo SEC front-end foram coletados.
Experimento
A solução BSA foi preparada em tampão PBS a uma concentração de 5 mg/mL, agitada eletromagneticamente por 10 minutos e filtrada através de um filtro à base de água de 220 nm antes do uso.
A injeção e a separação foram realizadas através do SEC front-end com um detector RI.
Posteriormente, os componentes individuais separados entraram no BeNano para medição de tamanho a 25 °C.
Condições cromatográficas:
- Fase móvel: tampão PBS
- Taxa de fluxo: 0,4 mL/min
- Volume de injeção: 100 μL
Resultados e discussão
Figura 1:
As curvas do efluente na Figura 1 demonstram vários picos para BSA no volume total do efluente de 16 mL. Os picos em torno de 6 mL representam picos agregados, com picos entre 8-10 mL representando oligômeros separados. O pico principal final em torno de 10,5 mL representa o monômero de BSA. A área maior do pico principal indica que a maioria da proteína existe como monômeros.
Os tamanhos de partículas decrescentes detectados na curva de tamanho do efluente (pontos vermelhos) correspondem bem com os princípios da separação SEC. Isso confirma a eficácia do SEC front-end na separação de amostras e valida o BeNano como um detector, efetivamente obtendo informações de tamanho de partícula para cada componente do efluente.
As figuras 2 e 3 convertem a curva cromatográfica do efluente em curvas de distribuição de intensidade, identificando claramente os oligômeros separados, com o monômero a 7,21 nm, em excelente concordância com o tamanho teórico dos monômeros BSA (~7 nm). Tamanhos e áreas de outros componentes de efluentes estão listados na Tabela 1.
Tabela 1:
Distribuição medida Picos de BSA
A curva de distribuição de intensidade na detecção em modo de lote (Figura 4) revela apenas dois picos. O pico menor (em torno de 10 nm) corresponde à distribuição de tamanho de monômeros, dímeros, trímeros e outros poligômeros, enquanto o pico maior (em torno de 100 nm) representa agregados maiores.
A comparação entre o modo de fluxo e os resultados de detecção em modo de lote na Figura 5 indica que o modo de fluxo pode distinguir com sucesso componentes de oligômeros com diferenças de tamanho muito pequenas dentro do tamanho pequeno.
Conclusão
O BeNano com modo de fluxo foi usado como um detector em conjunto com um dispositivo de separação de front-end, aumentando significativamente a resolução da medição de tamanho. Ao medir BSA, esta nota de aplicação demonstrou a capacidade de detecção do modo de fluxo BeNano, mostrando efetivamente seu potencial no campo de medições de tamanho de alta resolução.